I 3 metodi di preparazione dell'olio di oliva alla Cannabis

estrazione olio cannabis

Tecnologie digitali applicate al controllo del processo in un unico passaggio di preparazione dell’olio di oliva alla cannabis

Di Paolo Bongiorno, Antonio Lopalco, Antonella Casiraghi, Antonio Spennacchio, Alessandro Pitruzzella, Angela Assunta Lopedota, Paola Minghetti e  Nunzio Denora

 
Farmacia Dott. Paolo Bongiorno, Via Vittorio Veneto 17/19, 92026 Favara, AG, Italia.
 
Dipartimento di Farmacia – Scienze Farmaceutiche, Università degli Studi di Bari Aldo Moro, Via Orabona 4, 7012 Bari, BA, Italia.
 
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università degli Studi di Milano Via G. Colombo 71, 20133 Milano, MI, Italia.
 
Biomedicina, Neuroscienze e Diagnostica Avanzata, (BIND) Università di Palermo, Piazza Marina, 61, 90133 Palermo, PA, Italia.
 
Autore al quale deve essere indirizzata la corrispondenza.
Questi autori hanno contribuito in egual misura al lavoro.
 
Farmaceutica 2023 , 15 (3), 870; https://doi.org/10.3390/pharmaceutics15030870
Presentazione ricevuta: 15 gennaio 2023 / Revisionato: 16 febbraio 2023 / Accettato: 6 marzo 2023 / Pubblicato: 8 marzo 2023

Estratto

La riproducibilità di una preparazione estemporanea è una condizione essenziale per garantire la qualità, l’efficacia e la sicurezza del medicinale.
 
Questo studio mirava a sviluppare un processo controllato in un unico passaggio per preparazioni di olio di oliva di cannabis mediante l’applicazione di tecnologie digitali.
 
A tale scopo, il profilo chimico dei contenuti di cannabinoidi negli estratti di olio delle varietà Bedrocan, FM2 e Pedanios ottenuti con il metodo già in uso, proposto dalla Società Italiana dei Farmacisti Preparatori (SIFAP), è stato confrontato con due nuovi metodi, nello specifico il metodo di estrazione Tolotto Gear ® (TGE) e il metodo di estrazione Tolotto Gear ® preceduto da una procedura di pre-estrazione (TGE-PE).
 
Le analisi HPLC hanno mostrato che la concentrazione di THC utilizzando flos di cannabis con un alto contenuto di THC (oltre il 20% w / w ) era sempre superiore a 21 mg/mL per la varietà Bedrocan e vicina a 20 mg/mL per la varietà Pedanios quando si applicava TGE, mentre con TGE-PE, la concentrazione di THC era superiore a 23 mg/mL per la varietà Bedrocan.
 
Per la varietà FM2, le quantità di THC e CBD nelle formulazioni di olio ottenute utilizzando TGE erano superiori a 7 mg/mL e 10 mg/mL, rispettivamente, e per TGE-PE, le concentrazioni di THC e CBD erano superiori a 7 mg/mL e 12 mg/mL, rispettivamente. Sono state eseguite analisi GC-MS per definire i contenuti di terpeni negli estratti di olio.
 
I campioni di flos Bedrocan estratti con TGE-PE hanno mostrato un profilo distintivo, altamente ricco di terpeni e privo di prodotti volatili ossidati. Pertanto, TGE e TGE-PE hanno permesso di effettuare un’estrazione quantitativa di cannabinoidi e di aumentare le concentrazioni totali di mono-di-tri terpeni e sesquiterpeni. I metodi erano ripetibili e applicabili a qualsiasi quantità di materia prima, preservando il fitocomplesso della pianta.

1. Introduzione

La Cannabis sativa L. è una pianta erbacea a fioritura annuale appartenente alla famiglia delle Cannabinaceae [ 1 , 2 ].
 
È noto che la pianta contiene più di ottocento composti, tra cui le classi più importanti di principi attivi sono cannabinoidi, terpeni e flavonoidi.
 
I cannabinoidi, una classe di terpenofenoli [ 3 ], sono prodotti in abbondanza nei tricomi ghiandolari dei fiori femminili [ 4 ]. Tra questi, i due composti più rappresentativi sono l’acido Δ 9 -tetraidrocannabinolico (THCA) e l’acido cannabidiolico (CBDA) ( Figura 1 ).
 
Questi due cannabinoidi acidi subiscono una decarbossilazione spontanea sotto l’azione della luce e del calore, portando alla formazione di Δ 9 -tetraidrocannabinolo (THC) e cannabidiolo (CBD) ( Figura 1 ) [ 5 ].
Figura 1. Strutture molecolari dei principali cannabinoidi Δ 9 -tetraidrocannabinolo (THC), acido Δ 9 -tetraidrocannabinolico (THCA), cannabinolo (CBD) e acido cannabinolico (CBDA), e del monoterpene β-mircene e del sesquiterpene β-cariofillene.
 
Il THC, il principale costituente psicoattivo, è il composto attivo più importante presente nelle varietà di cannabis utilizzate sia per scopi medici che ricreativi [ 6 ].
 
Il CBD, presente nelle varietà di Cannabis sativa di tipo fibra e medicinale [ 6 , 7 , 8 ], mostra anche varie attività farmacologiche, come l’attività antiossidante, antinfiammatoria, antimicrobica [ 9 , 10 , 11 ] e neuroprotettiva [ 12 ], correlate all’azione su diversi bersagli [ 9 ].
I terpeni sono un’ulteriore classe ben rappresentata di composti attivi prodotti nelle infiorescenze di cannabis [ 7 , 10 ].
 
Tra i terpeni, il mircene ( Figura 1 ), il limonene, il trans-ocimene e il terpinolene sono i monoterpeni più rappresentati nella pianta, mentre il cariofillene ( Figura 1 ) e l’umulene sono i sesquiterpeni più abbondanti [ 7 , 10 ].
 
I trattamenti a base di cannabis rappresentano un’opportunità promettente, poiché le indicazioni suggeriscono un effetto sinergico tra cannabinoidi e terpeni che è superiore alle droghe sintetiche, noto come “effetto entourage” [ 13 , 14 , 15 , 16 , 17 ].
 
Le sommità fiorite femminili essiccate della pianta sono disponibili come materiale standardizzato di grado medicinale. Le indicazioni mediche più comuni della cannabis includono il dolore neuropatico [ 13 ]; dolore cronico resistente ai farmaci antinfiammatori non steroidei, ai corticosteroidi o agli oppioidi; glaucoma resistente alle terapie convenzionali [ 18 ]; denutrizione; nausea e vomito indotti dalla chemioterapia [ 19 , 20 ]; spasticità; e convulsioni nella sclerosi multipla [ 20 , 21 , 22 ].
 
È anche un utile agente terapeutico contro la cachessia e l’anoressia nei pazienti con cancro o sindrome da malattia autoimmune e anche nella riduzione dei movimenti del corpo nella sindrome di Gilles de la Tourette [ 23 ].
 
La cannabis terapeutica in Italia, come nel resto dell’Unione Europea, rappresenta una situazione irregolare [ 15 , 24 , 25 ]. Le varietà olandesi di Bedrocan ® (come Bedrocan ® , Bediol ® , Bedica ® e Bedrolite ® ) e i due ceppi FM1 e FM2 prodotti dall’Istituto Chimico Farmaceutico Militare di Firenze, Italia, possono essere prescritti insieme ad altri marchi importati regolamentati da bandi del Ministero della Salute italiano [ 26 ]. Le prescrizioni mediche a base di cannabis sono in aumento in diversi Paesi, dove l’uso terapeutico è autorizzato; ciò è dovuto al ruolo positivo della cannabis nel trattamento di diverse condizioni patologiche, con pochi effetti collaterali [ 27 , 28 ].
 
Pertanto, in molti paesi, i farmacisti sono legalmente autorizzati a formulare dosi di infiorescenze di cannabis per infusi, capsule micronizzate, vaporizzazione e oli macerati [ 22 , 28 , 29 , 30 ].
 
Nel caso dei compound farmaceutici, è importante trovare metodi di estrazione che consentano la conservazione dei complessi cannabinoidi/terpeni nei prodotti utilizzati a fini terapeutici. I preparati a base di cannabis terapeutica possono essere utilizzati per via orale o per inalazione [ 31 ].
 
Per quanto riguarda gli oli di cannabis medica per uso terapeutico orale, in letteratura sono stati descritti diversi metodi di estrazione [ 2 , 15 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ]. Tra questi, nel 2016 la Società Italiana dei Farmacisti Compounding (SIFAP) ha sviluppato e proposto un metodo per la preparazione di estratti galenici di olio di cannabis caratterizzato da rese elevate [ 15 ].
 
Il metodo SIFAP è una procedura in due fasi descritta per la preparazione di un piccolo lotto di estratto oleoso, nello specifico 5 g di infiorescenze estratte in 50 mL di olio d’oliva di grado farmacopea, che non consente di controllare l’intero processo di decarbossilazione dei cannabinoidi.
In relazione alla formulazione degli oli di cannabis medica, generalmente non viene prestata attenzione ai componenti terpenici della pianta.
 
Infatti, il processo di decarbossilazione, che viene solitamente applicato al materiale vegetale per convertire i cannabinoidi dalla forma acida a quella neutra ( Figura 1 ), può causare una perdita completa di questi componenti volatili.
 
Poiché il metodo e le condizioni di preparazione dell’olio di cannabis possono avere un impatto sulla composizione della formulazione, è importante lo sviluppo e l’ottimizzazione di un’efficiente procedura in un’unica fase che deve essere seguita dai farmacisti, per ottenere una formulazione finale di alta qualità e per garantire la riproducibilità dei risultati terapeutici.
 
A nostra conoscenza, nessuna delle procedure descritte per la preparazione dell’olio di cannabis garantisce estratti oleosi standardizzati, in particolare se applicati a quantità maggiori di infiorescenze di cannabis, producendo oleoliti con un diverso contenuto di molecole attive.
 
Questo limite si riflette nella difficoltà di confrontare studi clinici, in cui spesso vengono utilizzati estratti con caratteristiche diverse.
Alla luce di quanto sopra, in questo studio, con l’obiettivo di ottenere estratti oleosi di cannabis ricchi di cannabinoidi e terpeni, sono stati valutati due metodi di estrazione. Il processo di estrazione è stato eseguito utilizzando una tecnologia innovativa, denominata Pharmagear ®.
 
Questa strumentazione integrava un sistema di controllo di processo automatizzato, in grado di controllare la temperatura e l’agitazione magnetica durante il processo di estrazione, e un reattore (Tolotto) in cui l’estrazione e la decarbossilazione dei fitocomplessi avvenivano in un unico passaggio.

2. Materiali e metodi

2.1. Chimico e solvente

In questo studio sono stati utilizzati e acquistati diversi lotti di varietà di Cannabis sativa L. da diversi fornitori. Bedrocan (THC = 19–22%; CBD <1%) è stato acquistato dai fornitori Farmalabor srl (Canosa di Puglia, BT, Italia), Fagron Italia srl (Quarto Inferiore, BO, Italia) e Galeno srl (Carmignano, PO, Italia).
 
La cannabis Aurora Pedanios (THC 17–26%; CBD <1%) e FM2 (THC 5–8%; CBD 7,5–12%) sono state acquistate dall’Istituto Chimico Farmaceutico Militare – Agenzia Industrie Difesa (Firenze, FI, Italia).
 
L’olio extra vergine di oliva Caelo (Farmacopea Europea 9.3 (Eur. Ph. 9.3)) è stato acquistato da Comifar Distribuzione SPA (Novate Milanese, MI, Italia). Gli standard di cannabinoidi (T-093-1 mL Δ 9 -Tetraidrocannabinolic Acid; T-108-0.5 mL THC Cannabinoids Mixture-3; C-144-1 mL Cannabidiolic Acid (CBDA) utilizzati per la cromatografia erano di qualità analitica e sono stati acquistati da Merck (Milano, MI, Italia). Anche l’alfa-tocoferolo (Eur. Ph.) è stato acquistato da Merck (Milano, MI, Italia).

2.2. Apparecchiature e strumenti Pharmagear ®

Per la preparazione degli oli di cannabis è stata utilizzata una tecnologia innovativa denominata Pharmagear ® (Energicamente srl, Favara, AG, Italia; Nebiolo Ht, Assoro, EN, Italia) ( Figura 2 ).
 
Questo strumento riunisce un evaporatore a pressione ridotta, un estrattore di oli essenziali costituito da un maceratore accoppiato ad un agitatore magnetico intelligente e un reattore ( Figura 2 a–c). I processi di estrazione e decarbossilazione sono controllati da un sistema di controllo elettronico automatizzato che invia in tempo reale tutti i dati acquisiti al software PharmaGear 1.0 (Energeticamente srl, Favara, AG, Italia) su PC.
 
Ciò consente di monitorare e controllare l’intero processo di decarbossilazione e di misurare la CO 2 prodotta durante la fase di riscaldamento con un’apposita sonda di CO 2 ( Figura 2 d).
Figura 2. Tolotto, manometro e valvola del vuoto ( a ); sistema di controllo ( b ); Pharmagear® ( ) ; rappresentazione schematica del processo automatico di produzione degli oli di cannabis ( d ); strumenti del sistema di filtrazione ( e ); sistema di filtrazione assemblato costituito dal reattore (Tolotto) (1), connettore per la pompa a vuoto (2), e contenitore cilindrico in vetro per l’olio di cannabis (3) ( f ).
 
Tempi e temperature vengono programmati tramite un software prima della preparazione. Il sistema adatta il suo comportamento in base alle temperature prestabilite, al tempo di preparazione, alle fasi di estrazione e decarbossilazione, alla quantità di materia prima da riscaldare e alle variabili ambientali. Per la preparazione degli oli di cannabis sono state necessarie anche le seguenti attrezzature: Baoshishan FS-600 N Sonicator Ultrasonic Homogenizer 600 W Lab Sonicator Processor (Toption Instrument Co., Ltd., Xi’an, Cina); Turbo emulsifier Miccra Homogenizer (Riman SRL, Palermo, PA, Italia); sistema di filtraggio della pompa a vuoto collegato al reattore.

2.3. Preparazione degli Estratti di Cannabis in Olio di Oliva

Indipendentemente dalle quantità di cannabis da estrarre, per un lotto minimo sono stati pesati 5 g di Cannabis flos e 50 mL di Ph. Eur.
 
È stato misurato l’olio d’oliva, precedentemente raffreddato ad una temperatura compresa tra 2 e 8 °C. Il reattore è stato avvolto con gel di ghiaccio. Un’aliquota di 10 mL dell’olio è stata conservata e aggiunta alla fine dell’intero processo, per il lavaggio del reattore. I restanti 40 ml di Ph. Eur.
 
Nella piastra di reazione è stato introdotto l’olio di oliva insieme alle infiorescenze, precedentemente micronizzate, e disperse in olio mediante omogeneizzatore.
 
Eventuali infiorescenze di cannabis rimaste bloccate nella testa del rotore/statore dell’omogeneizzatore sono state spostate utilizzando una spatola ed è stato eseguito un secondo ciclo di miscelazione per diversi minuti. Quindi, la miscela nel reattore avvolto in gel di ghiaccio è stata sonicata con una sonda (Baoshishan FS-600 N Sonicator Ultrasonic Homogenizer 600 W Lab Sonicator Processor) con una potenza erogata di circa 200 W per 5 minuti e una frequenza di 20 kHz.
 
Un’ancora magnetica è stata inserita nella piastra di reazione, che a sua volta è stata chiusa con un coperchio ermetico.
 
La pompa da vuoto era collegata alla testa del reattore e l’ossigeno veniva eliminato per ridurre lo stress ossidativo dell’olio durante le successive fasi di riscaldamento. Il reattore è stato assemblato con un sistema di controllo ( Figura 2 c) e utilizzando il metodo di estrazione Tolotto Gear® ( TGE); possono essere utilizzate due modalità: TGE da solo o preceduto da una procedura di pre-estrazione (TGE-PE).
 
In particolare, il TGE consiste in una fase di estrazione condotta a 110 °C per 120 min e una fase di decarbossilazione a 146 °C per 80 min, mentre TGE-PE richiede una fase di pre-estrazione a temperatura ambiente (25–30 °C) per 12 ore prima di iniziare il processo di estrazione a caldo e successiva decarbossilazione, come descritto sopra per TGE ( Figura 3 ).
 
Al termine del processo, il reattore è stato rimosso dallo strumento e la sua temperatura è stata ridotta a 40°C con un involucro di gel di ghiaccio.
 
L’olio di cannabis estratto è stato filtrato utilizzando un sistema di filtraggio a membrana in nylon per uso alimentare (dimensione dei pori 37 μm) collegato a una pompa a vuoto (VidaXL50 L/minpotenza 120 W, grado di vuoto 50 Pa) ( Figura 2 f). Il reattore e l’ancora magnetica furono lavati con la frazione oleosa preservata, che fu aggiunta alla restante preparazione oleosa.
 
L’olio di cannabis ottenuto è stato conservato in una bottiglia di vetro ambrato e è stato aggiunto alfa-tocoferolo allo 0,05% v / v per prevenire l’ossidazione. Per i lotti con 10 e 15 g di materiale vegetale è stato utilizzato rispettivamente un volume di solvente di olio d’oliva di 90 e 140 ml per il processo di estrazione nel reattore.
 
Alla fine dell’intero processo è stata aggiunta un’aliquota di 10 ml di olio per lavare il reattore. In tutti gli esperimenti, il rapporto in volume farmaco:solvente dopo diluizione con 10 mL di frazione solvente di lavaggio è stato sempre mantenuto pari a 1:10.
Figura 3. Rappresentazione schematica della procedura SIFAP e dei metodi TGE e TGE-PE per la produzione di olio di cannabis utilizzando la tecnologia Pharmagear ® .

2.4. Estratto di Cannabis in Olio di Oliva con la Procedura SIFAP (Processo di Macerazione)

Secondo un metodo precedentemente riportato in letteratura [ 15 ], campioni da 5 g di Cannabis sativa L. sono stati decarbossilati in un forno a 115 °C per 40 minuti. Il materiale vegetale è stato quindi aggiunto a 50 mL di olio d’oliva e ulteriormente sminuzzato utilizzando un mixer.
 
L’estrazione è stata eseguita a 100°C per un periodo di 40 minuti, mantenendo un bicchiere aperto in un bagno di olio siliconico preriscaldato e agitato. Successivamente la miscela è stata immediatamente filtrata, per ottenere l’olio finale ( Figura 3 ).

2.5. Strumento e metodo HPLC

Lo strumento HPLC era un sistema a gradiente LC Agilent 1220 Infinity II VL dotato di un rilevatore UV a lunghezza d’onda variabile e software openLab DCS (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania). È stata utilizzata una colonna Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C 18 3,0 × 50 mm, 2,7 µm termostatata a 50 °C. È stata utilizzata l’eluizione a gradiente lineare ( Tabella 1 ) con una portata di 1,0 mL min −1 .
 
Il rilevamento UV è stato effettuato a 230 nm. In tutti gli esperimenti è stato utilizzato un volume di iniezione di 5 μL.
 
Il tempo di analisi è stato di 11 min (con 1,5 min per il riequilibrio).
Tabella 1. Gradiente della fase mobile HPLC.

Curva di calibrazione

I calibratori standard sono stati prodotti da standard di riferimento certificati CBD, CBDA, THC, THCA e cannabinolo (CBN), ciascuno a una concentrazione di 1,0 mg/mL in solvente organico.
 
Volumi equivalenti di ciascuno standard sono stati miscelati e diluiti con metanolo ad una concentrazione di 250 µg/mL. Sono state effettuate quattro diluizioni per generare una curva di calibrazione a concentrazioni di 250, 100, 50, 10 e 1,0 µg/mL. Le curve di calibrazione sono state create come risposta alla concentrazione e utilizzate per determinazioni di accuratezza, precisione e linearità, come descritto da Storm e colleghi.
 
Il metodo analitico utilizzato è stato quello descritto nel “test dedicato alla potenza dei cannabinoidi nella cannabis o nella canapa” di Agilent [ 35 ]. Il LOD (0,15 μg/mL) e il LOQ (0,50 μg/mL) sono stati determinati utilizzando il rapporto segnale/rumore (S/N) (LOD strumentale: S/N = 3 e LOQ: S/N = 10). Le soluzioni standard sono state conservate al riparo dalla luce ad una temperatura di -20°C fino al momento dell’utilizzo.

2.6. Preparazione dei campioni e analisi di cannabinoidi e terpeni

L’analisi qualitativa e quantitativa del profilo dei cannabinoidi nelle formulazioni di olio di cannabis è stata effettuata utilizzando il metodo HPLC descritto nella Sezione 2.5 .
 
Strumento e metodo HPLC. Innanzitutto, aliquote da 50 µl o 500 µl di ciascun olio di cannabis concentrato omogeneizzato sono state pipettate in un matraccio tarato e diluite fino a un volume finale di 5 mL con etanolo di grado HPLC ad elevata purezza. Quindi, 2 ml di ciascuna soluzione sono stati filtrati utilizzando una siringa di vetro dotata di un filtro per siringa di cellulosa rigenerata da 0,45 μm.
 
È stata eseguita un’ulteriore diluizione di 10 volte della soluzione filtrata trasferendo un’aliquota da 100 µL in una fiala di vetro ambrato da 2 mL per autocampionatore e aggiungendo 900 µL di metanolo di grado HPLC ad alta purezza.
 
Quindi, i campioni preparati sono stati analizzati mediante HPLC.
La determinazione del profilo terpenico è stata effettuata secondo il metodo sviluppato da Aiello e colleghi per la valutazione dei composti organici volatili [ 36 ].

2.7. Analisi statistica

Le concentrazioni di cannabinoidi e terpeni nei campioni analizzati sono state espresse sia come valori medi che come deviazione standard correlata (DS). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Per rivelare potenziali caratteristiche discriminanti tra i gruppi, è stato eseguito un test di analisi della varianza (ANOVA) unidirezionale.
 
Il test di confronto multiplo di Bonferroni (MCT) è stato applicato come test post hoc. I gruppi sono stati progettati considerando le varietà di cannabis (Bedrocan, Pedanios e FM2) e il protocollo di estrazione (TGE, TGE-PE e SIFAP). Le variabili significative sono state espresse da un valore p con una soglia < 0,05.

3. Risultati e discussioni

La preparazione di formulazioni di olio di oliva di grado farmaceutico di Cannabis sativa L. per uso medico richiede solitamente una fase di decarbossilazione seguita da una procedura di estrazione. Quest’ultima, chiamata metodo SIFAP, è una delle più ampiamente utilizzate.
 
In questo studio, è stata studiata l’applicazione di una nuova tecnologia one-step volta a proteggere il fitocomplesso dalla degradazione durante la procedura di estrazione. Per mezzo di una nuova piattaforma tecnologica, denominata Pharmagear ®, sono stati confrontati due metodi, denominati TGE e TGE-PE, per la preparazione di formulazioni di olio di oliva di grado farmaceutico, in termini di rese di cannabinoidi e terpeni estratti.
 
La quantificazione dei cannabinoidi è stata ottenuta mediante HPLC e un cromatogramma rappresentativo è riportato nella Figura 4 .
Figura 4. Cromatogramma HPLC rappresentativo della formulazione dell’olio Bedrocan ottenuto utilizzando il metodo TGE ( A ) e cromatogramma di calibrazione degli standard per gli analiti utilizzati nello studio ( B ).
 
La tabella 2 mostra le quantità di THC, THCA, CBN, CBD e CBDA ottenute utilizzando i metodi TGE e TGE-PE. All’inizio del 2022, la varietà Pedanios non è stata fornita da nessun fornitore per completare lo studio utilizzando TGE-PE; pertanto è stato possibile effettuare esperimenti solo utilizzando TGE.
 
Le concentrazioni (mg/mL) dei principi attivi sono espresse come valori medi con la loro deviazione standard (DS). Le concentrazioni di cannabinoidi sono risultate in linea con i dati disponibili in letteratura per ciascuna preparazione di materiale vegetale [ 2 , 28 , 31 ].
 
Tabella 2. Concentrazioni dei principi attivi (mg/mL) dopo l’estrazione di materiale vegetale medico Bedrocan, FM2 e Pedanios utilizzando i metodi TGE e TGE-PE ( n = 3; valore medio ± DS).
Poiché la resa estrattiva e i prodotti decarbossilati erano sempre prossimi al 100% del risultato ottenibile (considerando che Bedrocan e Pedanios hanno un contenuto dichiarato di THC nella pianta (somma di THC e THCA) prossimo o superiore al 20% w / w e FM2 ha un contenuto dichiarato di THC nella pianta in un intervallo di 5–8% w / w e di CBD 7,5–12% w / w ), nel complesso i metodi TGE e TGE-PE sono apparsi quasi equivalenti in termini di cannabinoidi estratti ( Tabella 2 ).
 
Questi risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti utilizzando il metodo SIFAP, uno dei metodi di estrazione ad alta capacità più diffusi. Il confronto è stato eseguito sulla base dei dati riportati in letteratura e di un nuovo set di dati sperimentali.
Nel periodo dal 2017 al 2019, centinaia di campioni sono stati preparati dai farmacisti e analizzati dall’Università di Milano [ 34 ].
 
Nonostante un contenuto di THC prossimo o superiore al 20% p / p , è stata ottenuta un’estrazione media di 12,236 ± 3,31 mg/mL utilizzando le varietà di Cannabis flos Bedrocan e Pedanios ( n = 800 ), mentre il THCA residuo era inferiore a 1,8 mg/mL. Nel caso di FM2 ( n = 350 ), il valore medio di THC era 5,06 ± 1,01 mg/mL e di CBD era 7,268 ± 1,84 mg/mL ( Tabella 3 ).
 
Tabella 3. Concentrazione del principio attivo cannabinoidi (mg/mL) espressa come valore medio determinato nel periodo dal 2017 al 2019 analizzando 800 campioni per varietà di Cannabis flos (Bedrocan e Pedanios) con un contenuto di THC (somma di THC e THCA) prossimo o superiore al 20% p / p, e 350 campioni per una varietà di Cannabis flos (FM2) con un contenuto di THC (somma di THC e THCA) compreso tra il 5 e l’8% p / p e di CBD compreso tra il 7,5 e il 12% p / p .
Le capacità di estrazione dei due metodi proposti ( Tabella 2 ) utilizzando la piattaforma innovativa sono state quasi raddoppiate rispetto a quelle descritte in letteratura [ 34 ]. La concentrazione di THC utilizzando fiori di cannabis con alto contenuto di THC (oltre il 20% w / w ) è stata sempre superiore a 21 mg/mL per la varietà Bedrocan e prossima a 20 mg/mL per la varietà Pedanios quando si applica il metodo TGE, mentre con il metodo TGE-PE utilizzato con la varietà Bedrocan, la concentrazione di THC è stata superiore a 23 mg/mL.
 
È stata riscontrata una differenza significativa ( valore p < 0,01) tra le quantità di THC nelle formulazioni di olio della varietà Bedrocan ottenute quando si applicano i metodi TGE e TGE-PE. Inoltre, per FM2, le quantità di THC e CBD nelle formulazioni di olio ottenute utilizzando il metodo TGE erano superiori a 7 mg/mL e 8 mg/mL, rispettivamente ( Tabella 2 ), e per il metodo TGE-PE, le concentrazioni di THC e CBD erano superiori a 7 mg/mL e 12 mg/mL, rispettivamente ( Tabella 2 ).
 
Le quantità di THC estratte dalla varietà FM2 con entrambi i metodi TGE e TGE-PE erano più elevate e statisticamente significative ( valori p < 0,01) rispetto ai valori medi riportati in letteratura [ 34 ] ( Tabella 3 ), mentre le quantità di CBD estratte dalla varietà FM2 con solo metodo TGE-PE erano statisticamente significative ( valori p < 0,01) rispetto ai risultati SIFAP
 
Non sono state osservate differenze significative tra i contenuti di THC nelle formulazioni di olio prodotte utilizzando diverse quantità di cannabis flos e olio d’oliva (5:50, 10:100 e 15:150, Tabella 2 ). I risultati dei test effettuati con tre diverse quantità di materiale vegetale supportano il fatto che i metodi sono adatti anche per più lotti.
 
Alcune differenze in termini di quantità di THCA e CBDA determinate nell’analisi HPLC utilizzando diverse quantità di cannabis flos e olio potrebbero essere attribuite ai contenuti residui di questi cannabinoidi nei vari lotti di materiale vegetale acquistati da diversi fornitori.
 
Per confermare i vantaggi offerti dalla nuova piattaforma Pharmagear ® , il metodo TGE è stato confrontato con i nuovi risultati sperimentali SIFAP (processo di macerazione). La Tabella 4 mostra il contenuto in mg/mL di cannabinoidi nelle formulazioni di olio dopo l’estrazione di 5 g di cannabis flos varietà Bedrocan.
 
Tabella 4. Concentrazioni di principi attivi (mg/mL) dopo l’estrazione di materiale vegetale medicinale Bedrocan (5 g) utilizzando i metodi TGE e SIFAP. I risultati sono stati determinati attraverso l’analisi dei cromatogrammi delle formulazioni di olio con volumi finali di 50 mL ( n = 3; valore medio ± deviazione standard, SD).
Come si può vedere dalla Tabella 4 , i risultati sperimentali ottenuti erano in accordo con i dati riportati in letteratura [ 34 ]. Il contenuto di THC nella formulazione dell’olio prodotto utilizzando il metodo TGE era significativamente diverso ( p < 0,01) dal contenuto nella formulazione ottenuta utilizzando il processo di macerazione.
 
Il profumo caratteristico della cannabis è il risultato della presenza di circa 140 diversi terpeni e terpenoidi. I terpeni sono una miscela di diversi composti costituiti da multipli dell’unità isoprenica (C 5 H 8 ). β-mircene, limonene, trans-ocimene e α-terpinolene sono i monoterpeni più abbondanti nelle infiorescenze di cannabis, mentre β-cariofillene e α-humulene sono i sesquiterpeni più rappresentati.
 
Questi composti hanno proprietà antiossidanti, antinfiammatorie, ansiolitiche e antibatteriche. Durante il processo di preparazione della maggior parte degli oleoliti prodotti con vari metodi, il riscaldamento che viene applicato al materiale vegetale per convertire i cannabinoidi acidi in composti neutri riduce notevolmente la percentuale di terpeni più leggeri (monoterpeni).
 
L’uso di alte temperature aumenta la concentrazione di sesquiterpeni, a scapito dei monoterpeni. Per superare questo problema, il metodo TGE è stato progettato per eseguire un’estrazione in un ambiente ermetico, in modo da consentire la condensazione dei terpeni dopo il raffreddamento e sotto vuoto, al fine di eliminare lo stress ossidativo dell’olio durante il riscaldamento. In questo studio, è stata condotta un’indagine preliminare sulla capacità dei metodi TGE e TGE-PE di estrarre e preservare i terpeni utilizzando l’innovativa tecnologia Pharmagear ® .
 
TGE-PE differisce dal primo perché utilizza una pre-estrazione di 12 h a una temperatura di 30 °C.
Le concentrazioni in mg/Kg dei terpeni estratti da Bedrocan flos sono presentate nella Tabella 5 . Le concentrazioni di terpeni sono risultate in linea con i dati disponibili in letteratura per i preparati oleosi [ 25 , 31 ]. La quantità di terpeni conservati può essere utilizzata come indice di conservazione dei fitocomplessi.
 
Tabella 5. Terpeni nelle formulazioni oleose di Bedrocan flos. Concentrazioni di principi attivi (mg/Kg) dopo l’estrazione di 5 g di materiale vegetale medicinale utilizzando i metodi TGE e TGE-PE. Le quantità (valori medi utilizzando misurazioni duplicate) sono state determinate tramite analisi GC-MS di una formulazione oleosa con un volume finale di 50 mL.
I mono-di-tri terpeni erano altamente rappresentati nel campione analizzato ( Tabella 5 ). Nel complesso, i due metodi hanno mostrato una performance diversa, in termini di resa quantitativa finale dei terpeni estratti.
 
D’altro canto, il campione di Bedrocan flos estratto con il metodo TGE-PE ha mostrato un profilo distintivo, altamente ricco di terpeni e privo di prodotti volatili ossidati. Le molecole quantificate appartenenti a questa classe chimica erano α-pinene, limonene e β-cariofillene, mostrando un trend di aumento significativo quando si eseguivano procedure di pre-estrazione rispetto al metodo TGE. TGE-PE ha mostrato una maggiore capacità di estrazione in termini di terpeni ottenuti.
 
Sono stati estratti circa il 6% in più di principi attivi rispetto alla quantità estratta utilizzando il metodo TGE ( Tabella 5 ), anche se per i terpeni meno rappresentativi, in termini di concentrazione, questa differenza è stata amplificata. Inoltre, alcuni terpeni potevano essere estratti solo utilizzando il metodo TGE-PE ( Tabella 5 ). Cis-p-menth-2,8-dienolo, α-limonene diepossido, α-guaiene e 5-caranolo ( Tabella 5 ) erano presenti solo nella formulazione dell’olio ottenuta utilizzando il metodo TGE-PE e assenti nell’estrazione con il metodo TGE.
 
Utilizzando la nuova piattaforma, i due metodi proposti consentono di preservare le frazioni terpeniche, senza alcun aumento dei sesquiterpeni a scapito dei monoterpeni.
Durante il processo di decarbossilazione è stato possibile osservare un aumento della pressione interna del bagno, con conseguente compensazione della pressione negativa, dovuta alla formazione di CO 2 .
 
Questo fenomeno è indice di decarbossilazione. Il raffreddamento totale del Tolotto prima della sua apertura è determinante ed è ottimizzato per consentire la condensazione ed il recupero dei terpeni, che altrimenti andrebbero persi. Inoltre, la concentrazione molto bassa di CBN indicava una bassa degradazione del THC e, insieme agli elevati valori di THC, ciò confermava la validità dei metodi.
 
Il raffreddamento del Tolotto ha permesso la condensazione dei terpeni e la sua tenuta ha determinato la ridiscioglimento della fase vapore nel solvente secondo la legge di Henry (un gas che esercita una pressione sulla superficie di un liquido entra nella soluzione finché non ha raggiunto la stessa pressione esercita su di esso).
 
Aumentando proporzionalmente la pressione sopra il liquido, ciò aumentava la quantità di gas che passava in soluzione. La divisione dei metodi in due parti, estrazione e decarbossilazione nel Tolotto, è puramente ideale, nel senso che parte della decarbossilazione è avvenuta durante l’estrazione e viceversa.
 
La nuova tecnologia descritta in questo studio e i due metodi di estrazione utilizzati sono molto promettenti sia per le procedure di preparazione di una formulazione estemporanea di olio di Cannabis sativa L. per uso medico, sia per la standardizzazione della composizione chimica delle molecole bioattive negli estratti, e soprattutto per la presenza di terpeni (come si può vedere dai risultati preliminari in Tabella 5 ).
 
Tra questi, limonene, pinene, mircene e β-cariofillene, composti noti per essere individualmente responsabili degli effetti antinfiammatori, analgesici, antinocicettivi, ansiolitici e sinergici con i fitocannabinoidi [ 17 , 37 , 38 ], erano presenti in quantità elevata concentrazioni negli oleoliti prodotti utilizzando i metodi TGE e TGE-PE.
 
In questo contesto, sono state studiate e stabilite un’attività differenziale dei recettori dei cannabinoidi e l’inibizione della glicoproteina-P [ 39 , 40 ] da parte dei terpeni.
 
Inoltre, molti studi hanno dimostrato che i terpeni migliorano l’assorbimento di diversi ingredienti farmaceutici attivi, come analgesici e antinfiammatori [ 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 ]. Inoltre, una formulazione di cannabis contenente terpeni essenziali aveva una sinergia multi-target [ 47 ]. Infatti, ciascun componente del fitocomplesso potrebbe esercitare una bassa potenza terapeutica, ma la loro concomitante azione farmacologica si è rivelata altamente efficace e caratterizzata da una bassa tossicità [ 48 ].
 
Pertanto, è importante formulare preparati a base di olio di cannabis caratterizzati da un elevato contenuto di cannabinoidi e terpeni.

4. Conclusioni

Per standardizzare le condizioni di estrazione delle preparazioni oleose di cannabis terapeutica, SIFAP offre ai farmacisti una procedura adeguata. Sono stati proposti e adottati anche diversi metodi, ma tutti si basano su due fasi separate: processi di estrazione e decarbossilazione.
 
I metodi TGE e TGE-PE, basati su un’innovativa piattaforma automatica, hanno permesso l’estrazione del fitocomplesso in un unico passaggio, controllando l’intero processo di decarbossilazione dei cannabinoidi. Le analisi HPLC eseguite sulle formulazioni di olio hanno mostrato che le capacità di estrazione dei due metodi proposti utilizzando la piattaforma innovativa erano quasi doppie rispetto a quelle ottenute utilizzando la procedura SIFAP.
 
Il contenuto di THC nelle formulazioni di olio era superiore a 21 mg/mL per la varietà Bedrocan e vicino a 20 mg/mL per la varietà Pedanios quando si applicava TGE, mentre con TGE-PE la concentrazione di THC era superiore a 23 mg/mL per la varietà Bedrocan. Per la varietà FM2, le quantità di THC nelle formulazioni di olio ottenute utilizzando TGE e TGE-PE erano superiori a 7 mg/mL.
 
Le analisi GC-MS delle formulazioni di olio ottenute da Bedrocan flos estratto con TGE-PE hanno mostrato un profilo distintivo altamente ricco di terpeni e privo di prodotti volatili ossidati. Pertanto, l’applicazione dei metodi di estrazione TGE e TGE-PE ha permesso di produrre formulazioni oleose standardizzate con una maggiore composizione di cannabinoidi e concentrazioni totali di mono-di-tri terpeni e sesquiterpeni.
 
I risultati ottenuti sono rilevanti e consentono di esplorare un nuovo modo di pensare alle preparazioni nel laboratorio galenico. Moderni e accurati sistemi di controllo del processo di preparazione sanciscono l’ingresso della Tecnologia dell’Industria 4.0 o “Smart Factory” nel laboratorio galenico e si prestano ad ulteriori sviluppi applicativi. L’automazione e l’accuratezza del sistema non richiedono il controllo continuo di un operatore durante le fasi di preparazione e consentono precisione, ripetibilità e assenza di errori umani.
 
L’attrezzatura sviluppata si è rivelata utile non solo per la preparazione dell’olio, ma anche per le capsule decarbossilate a base di cannabis terapeutica.
 
Sulla base della valutazione iniziale dei risultati ottenuti attraverso questa nuova tecnologia, verranno condotti ulteriori studi, in considerazione del fatto che la letteratura sul profilo terpenico presente negli estratti di cannabis terapeutica oleosa è molto scarsa.

5. Brevetto

Per il procedimento di produzione dell’olio di Cannabis è stato concesso un brevetto italiano dall’Ufficio Italiano Brevetti e Marchi (numero di brevetto 102019000014901, 3 agosto 2021).

Contributi dell’autore

Concettualizzazione, PB, ND e AL; metodologia, PB; convalida, PB, PM e ND; analisi formale, PB, AC, AS e AAL; indagine PB, AC, AS e AAL; risorse, PB; cura dei dati, PB, AS, AAL e AL; scrittura: preparazione della bozza originale, AL, ND e PB; scrittura: revisione e modifica, AL, AAL, ND, PB e AP; visualizzazione, AAL e ND; supervisione, PB, AL, PM e ND; amministrazione del progetto, AL e PB; acquisizione dei finanziamenti, PB Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento

Questa ricerca non ha ricevuto finanziamenti esterni da agenzie del settore pubblico, commerciale o non-profit.

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale

Non applicabile.

Dichiarazione di consenso informato

Non applicabile.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati

Non applicabile.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Pasquale Alba, Alfredo Silvano e Diego Zagarella di Energicamente srl, Favara (AG), Italia per la loro assistenza tecnica. Gli autori sono inoltre grati all’Università di Bari Aldo Moro e all’Università di Milano.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che potrebbe essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

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